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6第五章诊断用制品制造技术

  6第五章诊断用制品制造技术_能源/化工_工程科技_专业资料。第四章 第五节诊断用生物制品制造技术 诊断用生物制品 (diagnosticum) ? ? ? ? 包括诊断用抗原、诊断用抗体(血清)和标 记抗体等三类。 该类制剂的最基本要求是特异性强和

  第四章 第五节诊断用生物制品制造技术 诊断用生物制品 (diagnosticum) ? ? ? ? 包括诊断用抗原、诊断用抗体(血清)和标 记抗体等三类。 该类制剂的最基本要求是特异性强和敏感度 高。生物制剂用于诊断的原理(略) 诊断液: 利用细菌、病毒和寄生虫培养物、代谢物、 组分(提取物)和反应物等有效物及动物血 清等材料制成的,专门用于动物传染病和寄 生虫病诊断和检疫的一大类制品。 一、诊断抗原 ? ? ? ? (一)血清学诊断抗原 血清学诊断抗原是用已知微生物和寄生虫、微生 物和寄生虫的组分或浸出物、代谢产物、感染动物组 织制成,用以检测血清中的相应抗体 该类制剂可与血清中的相应抗体发生特异性反应, 形成可见或可以测知的复合物,以确诊动物是否受微 生物感染或接触过某种抗原。 常用的抗原有凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补 体结合反应抗原和酶联免疫吸附试验(ELISA)抗原 等。 1、凝集反应抗原 ? ? ? ? 凝集反应抗原是颗粒性抗原,如细菌和红 细胞等。 在有电解质存在条件下,能与特异性抗体 结合,形成肉眼可见的凝集现象。 举例: 布鲁氏菌凝集反应抗原、马流产凝集反应 抗原、鸡白痢全血凝集反应抗原、猪传染性萎 缩性鼻炎I相菌抗原和鸡源支原体平板凝集反应 抗原等。 布鲁氏菌凝集反应抗原 制造及使用方法 ? ? ? ? ①菌种 抗原性良好的2~3种布鲁氏菌。菌落须为光 滑型。 ②制造要点 将检定合格的种子液,接种于适于布鲁 氏菌生长的琼脂扁瓶上(或液体通气培养基),37℃ 培养2~3d; 加入适量0.5%石炭酸生理盐水,洗下培养物,经纱 布过滤,涂片杂菌检查。 热凝集和吖啶黄凝集试验合格的过滤菌液,在70~ 80℃水浴中杀菌lh,观察无凝集块出现,离心,将下 沉菌体重新悬浮于0.5%石炭酸生理盐水中,此即为 浓菌液,置2~10℃冰箱中保存备用。 ③标化 ? ? 用石炭酸生理盐水将浓菌液稀释为1:20、 1:24、1:28、1:32、1:36,5个不同稀释度, 将标准阳性血清稀释为1:300、1:400、1:500、 1:600、1:700,5个稀释度。 将稀释的抗原和血清排成方阵进行试管凝 集试验,每只反应管中加抗原和血清各0.5ml, 37℃ 24h观察结果。 观察/测定 ? ? 当标准阳性血清对标准抗原的凝集价为1:1000“++” 时,在血清1:1000稀释度呈现“++”,1:1200呈现 “-”,“±”或“+”的凝集现象的抗原最小稀释度,即 为浓菌液应稀释的倍数。在下表中(举例)浓菌液的稀 释倍数为1:28,此即为标化抗原的初测结果。 然后再以同法作一次测定,如果第二次结果仍为 1:28倍,则此批浓菌液作1:28倍稀释,即为使用液。 出厂的抗原原液比使用液浓20倍。 ? ? ? ? ? ? ? 菌 液稀释 ? ? ? ? 1:20 1:24 1:28 1:32 1:36 标准抗原 (1:20) 血清最初稀释度 1:300 1:400 1:500 1:600 1:700 加入抗原后的血清稀释度 1:600 1:800 1:1000 1:1200 1:1400 +++ ++ + +++ ++ + ++++ +++ + + ± ++++ +++ ++ + ++++ +++ ++ ++ ++++ +++ ++ - ④成品检验 ? 抗原应为乳白色均匀菌液,没有摇不散 的凝块或杂质,没有任何细菌生长。对标 准阳性血清1:1000倍稀释出现“++”凝 集,对阴性血清1:25~1:200稀释均不出 现凝集。 2、沉淀反应抗原 ? ? 沉淀反应抗原为胶体状态的可溶性抗原,如细菌和寄 生虫的浸出液、培养滤液、组织浸出液、动物血清和 动物蛋白等,与相应抗体相遇,在二者比例合适并有 电解质存在时,抗原抗体相互交联形成免疫复合物达 一定大时,即出现肉眼可见的沉淀。 沉淀抗原是细胞浸出成分,为细微的胶体溶液, 单个抗原的体积小而总面积大,出现反应需要的抗体 量多,故试验时常采取稀释抗原加不稀释的血清,并 以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。 沉淀反应抗原分类 ? ? 由于使用方法不同,沉淀反应抗原又分为环状 反应抗原,如炭疽动物脏器抗原;絮状反应抗 原,如测定抗毒素效价的絮状反应抗原;琼脂 扩散反应抗原和免疫电泳抗原等。 我国用于畜禽沉淀反应抗原有马传染性贫 血琼脂扩散反应(AGP)抗原、鸡传染性法氏囊 病AGP抗原、及马立克氏病(MD)AGP抗原等 多种。 马立克氏病(MD)AGP抗原 ? ? 用11~13日龄的鸭胚制备成纤维细胞单层培养物, 24h后接种MD病毒感染鸡的脾细胞悬液。接种后24h, 吸出接种物并更换营养液,接毒后约6d,消化细胞, 分瓶,传3代后,细胞培养物即可用于制备MD沉淀抗 原。 一般在75%以上的细胞出现病变时进行收获,在20℃以下冻结,室温融化,如此反复冻融3次,经适当 浓缩后即为抗原。用双扩散法进行诊断。 3、补体结合反应(CF)抗原 ? ? ? ? ? ? 补体结合反应包括反应系统(检测系统)和指示系统 (溶血系统)。 反应系统为抗原和抗体。 指示系统是绵羊红细胞及溶血素。 补体可与反应系统的抗原-抗体复合物结合,也可与绵 羊红细胞-溶血素的复合物结合而引起溶血,以观察溶 血与否来判定反应的结果。 在补体的参与下可明显地提高抗原、抗体特异性反 应的敏感性。 我国生产的兽用补体结合反应抗原有马传染性CF 抗原、鼻疽CF抗原、布鲁氏菌CF抗原和钩端螺旋体CF 抗原等。 鼻疽补体结合反应抗原的制造及检验程序 ? ? ① 菌种 用1~3株抗原性良好的鼻疽杆菌,接种 在4%甘油琼脂培养基上,37℃培养2d,经检定 合格者后用生理盐水洗下,作为种子培养物。 ② 制造要点 将种子培养物均匀地接种于甘油琼 脂扁瓶,37℃培养3~4d,挑选生长典型和无 杂菌污染者,用灭菌含0.5%石碳酸生理盐水洗 下培养物,121℃ 灭菌30min,置于2~15℃冷 暗处浸泡2~4个月,吸取上清液即为抗原,按 常规方法进行无菌检验。 ③ 效价测定 ? ? ? ? 将抗原用生理盐水作1:10、1:50、1:75、1:100、 1:150、1:200、1:300、1:400和1:500稀释。 用生理盐水将两份鼻疽阳性血清分别稀释成1:10, 1:25、1:50、1:75和1:100,在58~59℃水浴灭活 30min,按表4.5、4.6和4.7测定抗原效价。 对两份阳性血清的各种稀释液均发生最强的抑制溶血 现象的抗原稀释度,即为抗原效价。 在本例中,抗原效价为1:150。制成的抗原效价在 1:100以上认为可用。测定抗原效价后,取一份阴性马 血清作1:5和1:10稀释,在58~59℃灭活30min,然后 与新制抗原的一个工作量作补体结合反应,必须为阴 性,方认为合格。 (二)变态反应抗原 ? ? 细胞内寄生菌(如鼻疽杆菌,结核分支杆菌和布鲁氏菌 等),在传染过程中引起以细胞免疫为主的第IV型变态 反应,即感染机体再次遇到同种病原菌或其代谢产物 时出现一种具有高度特异性和敏感性的异常反应。据 此,临床上常用于诊断某些传染病。 引起变态反应的抗原物质称为变应原(变态反应 抗原),如鼻疽菌素、结核菌素和布鲁氏菌水解素等。 布鲁氏菌水解素是变态反应原性良好的布鲁氏菌水解 物,专用于绵羊和山羊布鲁氏菌病的变态反应诊断。 羊的皮肤变态反应在愈后1~1.5年才逐渐消失,所以 对污染羊群检出率高于血清学方法检测结果。 布鲁氏菌水解素制造方法 ? ? 1.菌种 培养特性和生化性状典型、热凝集试验和吖啶 黄凝集试验阴性、菌落为光滑型的布鲁氏菌, 变态反应原性良好,对布鲁氏菌阳性血清具有 高度的凝集性。 2. 制造要点 ? ? ? ? 将种子菌液接种于肝汤琼脂扁瓶培养基上37℃ 培养2~7d(或液体通气培养36h), 用0.5%石炭酸生理盐水洗下生长良好的培养物, 在70~80℃水浴中加热灭菌lh, 离心沉淀去上清,菌体悬浮于0.5%石炭酸生理 盐水中,再离心沉淀洗一次。 菌体悬浮于0.5%硫酸水溶液中,使悬液浓度大 致为布鲁氏菌试管凝集抗原液的2倍,盛于玻璃 瓶中,121℃加热30~40min,促使菌体水解。 制造要点 ? ? ? ? 室温或冰箱放置12~24h,吸取上清液,用 NaOH液调整为pH6.8~7.0, 再静置沉淀未水解部分。 上清液用蔡氏滤器过滤后75~80 ℃加热, 凯氏法测定总氮量(用标准水解素作对照), 用灭菌蒸馏水稀释滤液,使其最终总氮量为 0.4~0.5mg/ml(或与标准的水解素相同)。 3.质量标准 ? ? 除按《成品检验的有关规定》进行外, 须做如下检验: ①安全检验:取体重18~22g小鼠6只, 腹腔注射水解素0.5m1,观察10d,应全 部健活。 ②效力检验: ? ? ? 取体重350-500g豚鼠10只,皮下接种适量布鲁 氏菌令其感染致敏, 经30-40d,用标准水解素1:10稀释液0.1ml接 种于臀部皮内, 经24h和48h观察反应面积在100mm以上,即 可用作正式试验。 正式试验 ? ? ? ? ? ? 然后剃去合格豚鼠腹部两侧的被毛, 被检水解素和标准水解素分别作5和10倍稀释, 一侧腹部皮内注射0.1ml被检水解素, 另侧注射同量的标准水解素, 同时用两只未致敏的健康豚鼠,依前述方法和剂量注 射被检水解素,和标准水解素作为对照, 经24h和48h各观察一次,被检水解素肿胀面积的总和 应与标准水解素肿胀面积的总和一致,或比值不超过 0.1,对照豚鼠无反应为合格。 二、诊断抗体 ? ? ? 诊断抗体包括诊断血清和单克隆抗体等。 诊断血清简称抗血清(antiserum),是指 利用血清反应以鉴别微生物、鉴定病原血清型 或诊断传染病的一种含已知的特异性抗体的血 清。 通常以抗原免疫接种动物制成。有些血清则 需再经吸收除去非特异性抗体成分后供诊断用。 分类和定义 ? ? ? ? ? ? 含有多种血清型抗体的血清称为多价诊断血清,只对 一个型的称为单价诊断血清或称因子血清。 单含鞭毛抗体成分的血清称为H血清, 单含菌体成分的血清称为O血清。 针对菌毛和针对荚膜的均称为K血清。 血清中的抗体一般是由多个抗原决定簇刺激不同B细 胞克隆而产生的,故称之为多克隆抗体(polyclonal antibody)。 由一个B细胞克隆所分泌的抗体为单克隆抗体 (monoclonal antibody)。 三、标记抗体 ? ? ? 具有示踪效应的化学物质与抗体结合后, 仍保持其示踪活性和与相应抗原特异结合能 力,此种结合物称为标记抗体。 可借以示踪和检测抗原的存在及其含量, 多用于鉴定抗原和诊断疾病。 常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位 素。 (一)荧光素标记抗体技术 ? ? ? ? 将提纯的抗体球蛋白用冷pH7.2 PBS稀释成 10-20mg/ml的浓度,按蛋白量的1/80和 1/100加入异硫氰酸荧光黄(FITC), 先用pH9.5 0.5M碳酸盐缓冲液溶解FITC, 于5min内滴加到抗体球蛋白溶液中, 最后补加碳酸盐缓冲液,使其总量为抗体球 蛋白溶液量的1/10; 标记 ? ? ? ? ? 在4℃搅拌标记12~15h(20~25℃ 1~ 2h): 用大量的pH7.2 PBS透析4h, 用Sephadex G-50凝胶滤除标记抗体中游 离荧光素,通过DEAE纤维素层析除去过 高标记和未标记的蛋白分子; 最后测定效价和特异性,分装保存。 标本染色分直接染色法和间接染色法 (二)酶标记抗体技术 ? ? 常用方法有戊二醛一步法、戊二醛二步法和 过碘酸钠氧化法三种。本文只介绍过碘酸钠 氧化法。 其原理是辣根过氧化物酶(HRP)含18%碳 水化合物,过碘酸钠将酶分子表面的多糖链 氧化为醛基,用硼氢化钠中和多余的过碘酸。 酶上的醛基很活泼,可与蛋白质的氨基结合。 标记步骤: ? ? ① 取5mg HRP溶于1.0ml新配制的 0.3mo1 pH8.2的NaHCO3,溶液中。 ②滴加0.1ml l% 2,4二硝基氟苯(FDNB) 无水乙醇溶液,室温避光轻轻搅拌1h。 ③加入1.0m1 0.06M过碘酸钠(NaIO4) 水溶液,室温轻搅30min。 标记步骤: ? ? ? ? ④加入lml 0.16M乙二醇,室温避光轻搅, 然后装人透析袋中。 ⑤于1000ml pH9.5 0.01M碳酸钠缓冲液 中,4?C透析过夜,其间换液3次。 ⑥吸出透析袋中液体,加入每毫升含IgG 5mg的pH9.5 0.01M碳酸钠缓冲液1m1, 室温避光轻轻搅拌2-3h。 ⑦加硼氢化钠(NaBH4)5mg,置4℃ 3h或过夜。 标记步骤: ? ? ⑧逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液,置 4℃1h后,4000r/min离心15min,弃上 清,沉淀。再用50%饱和硫酸铵沉淀2次。 ⑨沉淀物溶于少量pH7.4 0.01M磷酸缓冲 盐水液,装人透析袋,以同样缓冲盐水 液充分透析至无铵离子,l0000rpm离心 30min,上清液即为酶标记抗体。 该类制剂主要用于ELISA试验。 (三)放射性同位素标记抗体 技术 ? ? 目前多使用同位素碘作标记。125I半衰期较长 (60d)、同位素丰度大、辐射损伤小和计数率较 高。先将提纯的免疫抗体 IgG与同位素125I置试管 中,再加入氯胺T。由于碘化反应进行很快,故碘及 氯胺T必须在搅拌下加入,以免碘化不均匀,约 5min后加入还原剂偏重亚硫酸钠,阻断氯胺T作用 以终止碘化反应,再加入碘化钾作为碘离子的载体, 以减少蛋白分子吸附试剂中数量不稳定的放射性碘 离子。最后用过葡聚糖G-50柱等方法将游离碘及其 他放射性杂质与标记抗体分开。 该类标记抗体可用于检测相应的抗原。 第六节 治疗用生物制品制造技术 ? ? ? 一、概 述 治疗用生物制品是指用于治疗动物传染病的制品。 一般是利用微生物及其代谢产物等作为免疫原,经反 复多次注射同一动物体,所生产的一类含高效价抗体, 主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛奶抗体等。 高度免疫血清简称“高免血清” (hyperimmune serum),又称免疫血清(immune serum)或抗血清(antiserum)。可分为抗病血清和 抗毒素两类。该类制剂治疗或预防某些相应的疾病, 具有很高的特异性。也用作被动免疫,紧急预防和治 (一)作用机理 ? ? ? 含有特异性的免疫球蛋白—抗体输入动物体后, 动物即可被动地获得了抗体,从而形成免疫力,即 所谓的人工被动免疫。 当动物己感染某种病原微生物发生传染病时, 注射大量的抗病血清后,由于抗体的作用,可抑制 动物体内的病原体继续繁殖,并协助体内正常防御 机能,消灭病原微生物,使病畜逐渐恢复健康。 该作用具有很强的特异性,一种血清只对相应的 一种病原微生物或毒素起作用。 (二)应用 ? ? 用作紧急预防注射,通常是在已经发 生传染病或受到传染病威胁的情况下使 用,其优点是注射后立即产生免疫。 但是这种免疫力维持时间较短,一般 仅2~3周,因此,在注射血清后2~3周 仍需再注射一次疫苗,才能获得较长时 间的抗传染能力。 举例 ? ? ? ? ? ? 抗炭疽血清、 破伤风抗毒素、 抗羔羊痢疾血清、抗气肿疽血清、 抗猪瘟血清、 抗小鹅瘟血清、 抗传染性法氏囊病血清; 抗犬瘟热血清等, 其中,破伤风抗毒素血清的效果最佳, 应用最广。 二、制造高免血清用动物的选择与管理 ? ? ? ? ? (一) 动物的选择 1. 动物的品种 用于制备免疫血清的动物有马、牛、 山羊、绵羊、猪、兔、犬、鸡和鹅等。 制备抗菌和抗毒素血清多用异种动物,通常用 马和牛等大动物制备。如破伤风抗毒素多用青年马 制备,抗猪丹毒血清多用牛制备。 抗病毒血清的制备多用同种动物,如犬瘟热血 清用犬制备,抗猪瘟血清用猪制备。 总的来看,制备免疫血清用马较多,因为血清渗 出率较高,外观颜色较好。也可使用多种动物制备 一种抗毒素血清,以避免发生过敏反应或血清病。 选定动物应有一定的数量,一个批次应用多头动物。 2. 动物的年龄及健康情况 ? ? ? 通常选择体型较大、性情温驯、体质强健的青壮 年动物为宜。马以年龄3~8岁、体重350kg以上者为 宜;牛以3~10岁、体重300~400kg以上为宜;猪以 50kg以上,年龄6~12月龄为宜;家免体重需达2kg以 上为好。 供制造免疫血清的动物,必须从非疫区选购,经过 严格检疫,并经隔离观察,每日测温两次,观察二周以 上,确认健康者方可应用。最好自繁自养动物,或由 专门饲养场提供标准化的SPF或其他级别的动物。 对某些购进动物进行必要的和对制备抗血清无影响 的预防免疫接种。 (二)动物的管理 ? ? ? ? 符合要求的动物:动物应在隔离条件下饲养,杜绝 高免时强毒及发病时散毒。应详细登记每头动物的来 源、品种、性别、年龄、体重、特征及营养状况、体 温记录和检疫结果等,建立制造血清动物的档案。 严格的管理制度。:由专人负责喂养和精心管理。 加强日常饲养管理,喂以营养丰富的饲料,并加喂多 汁饲料,最好能经常喂给一些胡萝卜,还须喂给适量 的食盐和含钙的补充饲料。 在高免和采血期间,每日要检测体温两次,随时观 察其健康情况。每日至少运动4h。在生产过程中,若 发现健康状况异常或有患病可疑时,应停止注射抗原 和采血,并进行隔离治疗。 动物采血前1d,禁食喂水,避免血中出现乳糜。 三、免疫原 ? ? ? ? 良好的免疫原应具备3个条件: 异物性、结构的复杂性和一定的物理性状。 一般来说,颗粒性抗原较可溶性抗原的 抗原性强,球形分子的蛋白质较纤维形分 子的免疫原性强,聚合状态的蛋白质较单 体状态的蛋白质免疫原性强。 分子量较小和抗原性较低的蛋白质应吸 附于载体上,才可获得较高的免疫原性。 制造抗病血清所用的免疫抗原 ? ? 要根据病原微生物的培养特性,采 用不同的方法生产。免疫原提纯和浓 缩十分必要。 根据需要,有时可加合适的免疫佐 剂。 1.抗细菌免疫血清制备 ? ? 基础免疫用抗原多为疫苗或死菌,而高度免疫 的抗原,一般选用毒力较强的毒株。 菌种接种于最适生长的培养基,按常规方法进行培 养。通常活菌抗原需用新鲜培养菌液,并按规定的浓 度使用,培养时间较死菌抗原稍短为好,多用16~ 18h 培养物,经纯粹检查,证明无杂菌者,即可作为 免疫抗原。 ? 抗细菌免疫血清制备 ? ? 在固体培养基上繁殖,加适量灭菌生理 盐水或缓冲盐水洗下菌苔,制成均匀的 菌悬浮液; 用液体培养基培养,应在生长菌数高 峰期(对数期)收获;为减少由培养基 带来的非特异性成分,可通过离心,弃 上清,再将菌体制成一定浓度的细菌悬 浮液,作为免疫原。 2.抗病毒免疫血清制备 ? ? ? ? 以病毒为免疫原,须通过反复冻融或超声裂解方 法,将病毒从细胞中释放出来,并尽可能地提高病 毒滴度和免疫原性。 如抗猪瘟血清,基础免疫的抗原,可用猪瘟兔化 弱毒疫苗;高度免疫抗原,则用猪瘟血毒或脏淋毒 乳剂等强毒。 猪接种猪瘟强毒发病后5~7d,当出现体温升高 及典型猪瘟症状时,由动脉放血,收集全部血液, 经无菌检验合格后即可作为抗原使用。 接种猪瘟强毒的猪,除血中含有病毒外,脾脏和淋 巴结也有大量的病毒,可采集并制成乳剂,作为抗 原使用。 3. 抗毒素血清制备 ? 免疫原可用类毒素、毒素或全培养物 (活菌加毒素),但后两者只有在需要 加强免疫刺激的情况下才应用,一般多 用类毒素作免疫原。 四、免疫程序 ? ? 免疫程序分为: 第一阶段为基础免疫,第二阶段为高度免疫。 (一)基础免疫 基础免疫通常先用本病的疫 苗按预防剂量作第一次免疫,经1~3周再用较 大剂量的灭活苗或活菌或特制的灭活抗原再免 疫1~3次,即完成基础免疫。 基础免疫大多数1~3次即可,抗原无须过多 过强,可为高度免疫产生有效的回忆应答打下 基础。 ? ? (二)高度免疫 ? ? ? 高度免疫亦称加强免疫,一般在基础免疫后2~ 4周开始进行。 注射的抗原采用强毒制造,微生物的毒力越强, 一般免疫原性越好。免疫剂量逐渐增加,每次注射 抗原间隔时间为3~10d,多为5~7d。 高免的注射次数要视血清抗体效价而定。有的只 要大量注射1~2次强毒抗原,即可完成高度免疫; 有的则要注射10次以上,才能产生高效价的免疫血 清。 (三)免疫途径 ? ? ? 免疫原注射途径一般采用皮下或肌肉注射。如 果免疫剂量大,应采用多部位注射法,尤其应用油 佐剂抗原时。 免疫程序对制备高免血清非常重要,掌握抗体 消长规律,适时免疫和采血尤为重要。 不能机械地定期免疫和采血。如有的动物在长 期免疫和采血过程中,可能会现抗体达到一定水平 后,反而逐渐降低,对免疫原的刺激无应答反应, 这可能与免疫剂量、免疫间隔时间和免疫原中混杂 免疫抑制物有关。此时,应给免疫动物足够时间休 息,解除免疫抑制作用,并调整免疫程序。 五、血液采集与血清提取 ? ? ? ? 按照免疫程序完成免疫的动物,经采血检验(试 血),血清效价达到合格标准时,即可采血。 (一)采血次数和方法 一般血清抗体的效价高峰在 最后一次免疫后的7~10d。采血可以全放血或部分采 血,采血时应尽可能地作到无菌操作。 全放血者,在最后一次高免之后的8~11d进行放血。 多次采血者,按体重每千克采血约10m1,经3~5d第 二次采血,按体重每公斤采8~10m1。第二次采血后 经2~3d,注射足量免疫原。 动物采血 ? ? ? ? ? ? 不合格者,再度免疫,多次免疫仍不合格者淘汰。 采血前,动物应禁食24h,但需饮水以防止血脂过高 豚鼠由心脏穿刺采血。 家兔可以从心脏采血或颈静脉、颈动脉放血,少量 采血可通过耳静脉采取。 马由颈动脉或颈静脉放血。 羊可以从颈静脉采血或颈动脉、颈静脉放血。 家禽可以心脏穿刺采血或颈动脉放血。 (二)血清的分离 ? ? ? 采血时一般不加抗凝剂,全血在室温中自然凝固, 在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。待血液凝 固后进行剥离或者将凝血切成若干小块,并使其与容 器剥离。先置于37℃ 1~2h,然后置于4℃冰箱过夜, 次日离心收集血清。 无菌的血清,组批分装,保存于之-15℃半成品库, 待抽检合格后交成品库保存出。 如果采集的血量较大时,可采用自然凝固加压法。 即将动物血直接采集于事先用灭菌生理盐水或PBS液湿 润的玻璃筒内,置室温自然凝约2~4h,有血清析出时, 每采血筒中加入灭菌的不锈钢压铊,经24h后,用虹吸 法将血清吸入灭菌瓶中,加入0.5%石炭酸或0.02%硫 柳汞防腐。 六、免疫血清的使用 ? ? ? ? ? ①正确诊断,尽早应用。特别是治疗时,应用越早效 果越好。 ②血清的用量根据动物的体重和年龄不同而确定。预 防量,大动物10~20m1,中等动物(猪、羊等)5~ 10ml。以皮下注射为主,也可肌肉注射。 治疗量需要按预防量加倍,并根据病情采取重复 注射。注射方法以静脉为好,以使其尽速奏效。 ③静脉注射血清的量较大时,最好将血清加温至30℃ 左右再注射。 ④皮下或肌肉注射,当血清量大时,可分几个部位注 射,并加揉压使之分散。 ⑤不同源的血清过敏反应 ? ? ? ⑤对不同动物源的血清(异源血清),有时可 能引起过敏反应。 如果在注射后数分钟或半小时内,动物出 现不安、呼吸急促、战抖、出汗等症状,应立 即抢救。 抢救的方法,可皮下注射 1:100肾上腺素, 大动物5~10m1,中小动物2~5m1,反应严 重者有时抢救不及时,常造成损失。 七、卵黄抗体的制备 ? ? ? 产蛋鸡(鸭和鹅)感染某些病原后,其血清和 蛋黄内均可产生相应的抗体。因此,通过免疫注射 产蛋鸡,即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体, 并可用于相应疾病的预防和治疗,该类制剂称为卵 黄抗体(yak antibody)。 近几年来,卵黄抗体已成为免疫血清的重要替代 品。卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本 较高、生产周期较长的弱点,并且具有用同批动物 连续生产的优点。 但是,卵黄抗体有潜伏野毒的危险,对生产用鸡应 做认真的检疫。 (IBD)卵黄抗体液的制备过程 ? ? 择健康无病的产蛋鸡群,开产前或已开产后, 以免疫原性良好的IBD油佐剂灭活苗肌肉注射, 2m1/只,以后每隔7~10d,重复注射一次,疫 苗剂量适度递增,三免后定期检测卵黄抗体水平, 待琼扩效价达1:128时开始收集高免蛋,4℃贮存 备用。 琼扩效价降到1:64时停止收蛋,可再进行加 强免疫。高免蛋合格时间大约持续一个月。 制造 ? ? 将高免蛋用0.5%新洁尔灭溶液浸泡或清洗消 毒,再用酒精棉擦拭蛋壳,打取鸡卵分离蛋黄。 根据卵黄抗体琼扩效价水平加入生理盐水进行 稀释(稀释后的卵黄抗体琼扩效价不低于1: 16~1:32),加青、链霉素各1000U (?g) /m1,加硫柳汞浓度达1/万,充分搅拌后分装于 灭菌瓶内4℃ 贮存。 每批都进行效价测定、细菌培养和安全检 验,合格后方可出厂。 一、冷冻真空干燥原理与特点 ? ? 一、冷冻真空干燥原理与特点 冷冻真空干燥,又称冷冻干燥(freeze drying),简称冻干。它是物质干燥的一种方 法。冷冻干燥的过程包括:将含有大量水分的 生物活性物质先行降温冻结成固体,再在真空 和适度加温(一般不超过40℃)条件下使固体 水分子直接升华成水汽抽出,最后使生物活性 物质形成疏松、多孔样固状物。 优点 ? ? ? ? ①能有效地保护热敏性物质的生物活性,如微 生物、抗原物质、血清制品、酶和激素等经冷 冻干燥后生物活性影响甚微。 ②能有效地降低氧分子对微生物和酶等活性物 质的作用,从而保护物质的性状; ③由于物质是在冻结状态下升华干燥,干燥物 呈海绵状结构,体积几乎不变,加水后能迅速 溶解并恢复原来状态; ④可除去冻干物质中的96%以上水分,对冻干 物的长期保藏十分有利。 三、 冻干机组与冻干程序 ? ? ? ? (一)冻干机组 制品的冷冻干燥需要在一定装置中进行。这个 装置叫做冷冻真空干燥机,简称为冻干机。 冷冻真空干燥系统由致冷系统、真空系统、 加热系统和控制系统四部分组成。 1、致冷系统 由冷冻机、冻干箱和冷凝器内 部的管道等组成。冷冻机的功能是使冻干箱和 冷凝器进行致冷,以维持冻干过程中的低温环 境。 (一)冻干机组 ? ? 2、真空系统 构成冻干机组的真空系统由冻 干箱、冷凝器、真空泵、真空管道和真空阀 门所组成。冻干时采用的线h 左右内达到要求的线、加热系统 不同冻干机组有不同的加热方 式,有利用电直接加热法,也有利用循环泵 将中间介质(传热流体)循环加热方式。加 热系统可使冻干箱加热至50℃,使物质中的 水分不断升华而干燥。 冻干机组 ? ? ? 4、控制系统 由各种控制开关、指示和记录仪表及自 动化元件等组成。控制系统的功能是对冻干机组进行 手动或自动控制,使其正常运行,保证冻干制品质量。 5、冻干箱 为一个能致冷到-40℃、加热到50℃并 能控制温度高低的温箱,同时也是个被抽成高真空的 密闭容器。物质在箱内进行冷冻及在真空下使水分子 升华被凝结在冷凝器内,从而达到干燥。 6、冷凝器 是一个致冷和真空的密闭器,内有一个能 降低-40℃以下的大面积金属表面,通过大口径真空阀 门与冻干箱连接,冻干箱内升华出的水汽以冰霜形式 凝结在冷凝器的表面,待冻干结束,冰霜融化后排出。 (二)冻干程序 ? ? ? 生物制品冷冻干燥的程序包括:液状制品分装 → 冻 干箱进行空箱降温 → 装箱 → 预冻 → 抽线℃左右)→ 第一步加热(温度低于共熔 点)→ 第二步加温(最高温度保持数小时)→ 结束 冻干,放气进入干燥箱 → 加塞封口。 整个升华干燥的时间与制品在每瓶内的装量、总 装量、玻璃容器的形状、规格、制品的种类、冻干 曲线及机器的性能等有关,通常为12~24h。 复习思考题 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1、基本概念 高免血清、卵黄抗体、冻干、诊断液、诊断抗原、 变态反应抗原、诊断血清、因子血清、标记抗体 2、制备高免血清和卵黄抗体的基本过程是什么? 3、简述高免血清作用特点和使用注意事项。 4、冷冻真空干燥的基本原理和意义是什么? 5、概述冻干机的基本组成和生物制品冻干的基本 过程。 6、诊断液应具备哪些特性?诊断液有哪些基本种 类。 7、简述诊断抗原和诊断血清的制备要点。 8、简述标记抗体的种类、制备基本过程以及应用。

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